Tämä opinnäytetyö tehtiin VTT:n immunodiagnostiikan työryhmässä, ja sen tavoitteena oli uuden seulontamenetelmän kehittäminen rekombinanttivasta-aineille.

Mallivasta-aineena tutkimuksessa käytettiin testosteronin ja sitä tunnistavan primäärisen vasta-aineen muodostamaa immunokompleksia tunnistavaa single chain variable fragment-alkaalista fosfataasi-fuusioproteiinia (scFv-AP). scFv-AP:tä koodaava synteettinen geeni transformoitiin Escherichia coli -bakteerisoluihin. Fuusioproteiinin toimivuus testattiin ELISA- ja immunoblot -menetelmillä, minkä jälkeen siirryttiin käyttämään aiemmasta kirjastoseulonnasta saatuja vasta-ainegeenipooleja.

Geenipoolit transformoitiin E. coli -soluihin ja niiden tuottotasoja tarkasteltiin ELISAlla. Poolit seulottiin yksittäispesäkkeinä VTT:n robottiasemalla, jolloin löydettiin 20 positiivista kloonia. Näiden kloonien plasmidi-DNA lähetettiin sekvensoitavaksi. Niille tehtiin myös tuottotasomääritykset Western blotilla, ELISAlla sekä alkaalisen fosfataasin entsyymiaktiivisuutta mittaamalla, minkä pohjalta valittiin kaksi kloonia suuren mittakaavan vasta-ainetuottoon.

Tuotetut vasta-aineet puhdistettiin IMAC-menetelmällä, minkä jälkeen niitä voitiin hyödyntää ELISA-pohjaisen immunokompleksimenetelmän kehityksessä. Puhdistetuilla vasta-aineilla optimoitiin ELISA-testiformaattia testaamalla eritasoisia vasta-aine- ja testosteronipitoisuuksia, sekä eri bakteerikasvatusmediumeja.

Tutkittua scFv-AP-fuusioproteiinia pystyttiin tuottamaan bakteerisoluissa, ja se kykeni tunnistamaan anti-tes-vasta-aineen ja testosteronin muodostaman immunokompleksin. Sen proteiinituottotasot jäivät kuitenkin vielä melko mataliksi.

Kehitetty ELISA-määritysmenetelmä vaikuttaa toimivalta, mutta sitä olisi vielä kokeiltava eri olosuhteissa, jotta voitaisiin varmistua sen yleispätevyydestä.