Maltogeeninen alfa-amylaasi on teollisuudessa fermentoimalla valmistettava tärkkelystä hydrolysoiva entsyymi, jota käytetään leivontatuotteiden tuoreuden ylläpitämisessä. Euroopan Unionin asettaman lain mukaan uudet ja olemassa olevat elintarvike-entsyymit tulee rekisteröidä ennen kuin ne voidaan sisällyttää hyväksyttyjen entsyymien luetteloon. Euroopan elintarviketurvallisuusvirasto EFSA valvoo ja arvioi tätä rekisteröintiä, johon kuuluu muun muassa geenimuunnellun tuotantokannan turvallisuuden arviointi. Rekisteröinnin yhtenä osana tulee luotettavan menetelmän avulla osoittaa, että elintarvikekäyttöön tuleva entsyymituote ei sisällä sen omaa tuotantokantaa.

Opinnäytetyön tavoitteena oli kehittää ja optimoida uudelle maltogeeniselle alfa-amylaasille sen tuotantokannan toteamismenetelmä, jota voidaan käyttää osana EFSA:lle tehtävää rekisteröintiä. Työn tarkoituksena oli määrittää tuotantokannan toteamismenetelmässä käytettävä optimaalinen entsyymipuolivalmistepitoisuus ja selvittää, voidaanko määritetystä puolivalmistepitoisuudesta havaita yksittäisiä tuotantokantasoluja. Kehitettyä menetelmää oli lopulta tarkoitus käyttää ensimmäiselle tehdasfermentoinnista saatavalle entsyymipuolivalmisteelle. Opinnäytetyö tehtiin teollisia entsyymejä valmistavalle Roal Oy:lle, missä työssä tutkittavaa maltogeenista alfa-amylaasia valmistetaan.

Kaikissa menetelmäkehitysvaiheissa tuotantokantaa kasvatettiin ravintoliuoksessa lämpöravistelijassa, minkä jälkeen kasvu varmistettiin mikroskopoinnilla sekä maltogeenisen alfa-amylaasin tuotantokannan havaitsemiseen soveltuvilla kasvatusmaljoilla. Tuotantokantasolut kasvoivat kaikissa entsyymipuolivalmistepitoisuuksissa 0,1–5,0 % välillä, kun siirrostettujen solujen määrä oli 166000 pesäkkeen muodostavaa yksikköä. Tuotantokanta kasvoi myös 1 % puolivalmistepitoisuudessa, jossa pienin siirrostettu solumäärä oli alle 5 pesäkkeen muodostavaa yksikköä. Yksittäisiä tuotantokantasoluja pystyttiin havaitsemaan myös rinnakkaisella määrityksellä. Kehitetyn menetelmän avulla analysoidusta tehdasmittakaavan puolivalmisteesta ei havaittu tuotantokantasoluja.

Tämän opinnäytetyön avulla saatujen tulosten perusteella voidaan jatkossa kehittää luotettava menetelmä maltogeenisen alfa-amylaasin tuotantokannan toteamiseen, mikä voidaan esittää osana EFSA:n valvomassa rekisteröinnissä. Menetelmän herkkyyttä sekä taustamikrobien vaikutusta tulee sitä ennen vielä arvioida ja määrittää.

Maltogenic alpha-amylase is an enzyme which can be industrially produced by fermentation. In the food industry it is used in bakery products as an anti-staling agent having the ability to hydrolyze starch. According to the law of the European Union, new and existing food enzymes must be registered before they can be included in the list of approved enzymes. The European Food Safety Authority EFSA is monitoring and evaluating this registration where risk assessment of genetically modified production strain is included. As part of the registration, it must be proved with a reliable method that the enzyme product does not contain its own production strain.

The aim of this study was to develop and optimize a reliable method for the detection of production strain in maltogenic alpha-amylase semifinal product that can be used as a part of the registration. The purpose was to determine the sample concentration of the semifinal product used in the detection method. In the second assay the purpose was to examine if single cells can be detected from the specified semifinal concentration. Finally, the objective was also to use the aforementioned method to analyze a sample of semifinal product produced in large scale fermentation. This thesis was done for the enzyme company Roal Ltd, where maltogenic alpha-amylase is produced.

The study was carried out by using the shake flask method to grow production strain cells in nutrient broth. The growth was confirmed by microscopy and by using selective agar plates. Production strain cells grew in all semifinal concentrations between 0,5–5,0 %, when the amount of cells was 166000 colony forming units. Single cells could also be detected from the 1 % semifinal concentration when the determination was carried out twice. The analyzed semifinal product produced in large scale fermentation proved to have no production strain cells.

The results obtained in this thesis can be used to develop a reliable method for the detection of production strain in maltogenic alpha-amylase enzyme. Before the EFSA registration the sensitivity of the method must be determined and the effect of background microbes need to be assessed.