Abstract

Human parturition is a complicated biological process and the molecular mechanisms regulating the onset of labor are not well understood. Several studies propose that gene variants, proteins and miRNAs play a major role in maintaining pregnancy and aberrations in protein and miRNA levels may lead to pregnancy complications. The levels of proteins and miRNAs could prove to be useful biomarkers for monitoring the onset of labor. In this study, using proteomics and a genome analysis, we identified Calcineurin-like phosphoesterase domain-containing protein (CPPED1), as a potential biomarker of labor. CPPED1 was found to be downregulated in spontaneous term placentas compared with placentas from elective deliveries. The siRNA knockdown of CPPED1 in trophoblasts derived cells mostly affects pathways related to inflammation and angiogenesis, and these functions may be involved in the induction of labor or in maintaining pregnancy. In bladder cancer cells, CPPED1 has been shown to dephosphorylate AKT1 on the Ser-473 residue and to promote apoptosis via the AKT/PI3K pathway. In our studies using cells of placental origin AKT1 phosphorylation levels were unaffected by CPPED1 expression, whereas its silencing led to the upregulation of negative regulators of the PI3K pathway. In a comparative miRNAomics screen of spontaneous term vs. elective term placentas, we identified 54 differentially expressed miRNAs, out of which 23 miRNAs were upregulated and 31 were downregulated by at least 1.5-fold. Among the upregulated miRNAs, miRNA-371a-5p targets CPPED1 and post-transcriptionally regulates its expression by binding to its 3’UTR region. In addition, we found that CPPED1 and miR-371a-5p levels inversely correlate with each other in spontaneous and elective term placentas. Measuring the levels of CPPED1 and miR-371a-5p levels in maternal blood could be a potential diagnostic biomarker for labor. In order to elucidate the functions of CPPED1 we used a protein microarray to identify proteins that interact with CPPED1 in vitro and obtained a list of 36 proteins that potentially bind CPPED1. The interaction of CPPED1 with PAK4 and PIK3R2 was confirmed by co-immunoprecipitation and investigation of the cellular localization by BiFC studies showed that CPPED1 and PAK4 are colocalized in the cytoplasm, whereas CPPED1-PIK3R2 complex on the cell membrane. Further, by a mass spectrometry analysis, we found that CPPED1 dephosphorylates PAK4 on five different serine residues. The functional importance of these phosphorylation sites is still unknown. PIK3R2 phosphorylation was unaffected by CPPED1. Based on our studies we propose that the levels of CPPED1 and miRNA-371a-5p in the maternal circulation could serve as biomarkers for the prediction of labor. The functional role of CPPED1 on PIK3R2 and PAK4 remains to be studied.

Tiivistelmä

Ihmisen synnytyksen käynnistyminen ja synnytys ovat monimutkaisia biologisia prosesseja, joiden kaikkia taustalla olevia molekyylimekanismeja ei vielä tunneta. Useat tutkimukset osoittavat, että tietyillä proteiineilla ja mikroRNA-molekyyleillä on tärkeä rooli raskauden ylläpitämisessä. Näiden proteiini- ja mikroRNA-määrien poikkeamat voivat johtaa raskauskomplikaatioihin. Proteiinien ja mikroRNA:n määrien mittaamista voitaisiin siten käyttää mahdollisina raskauskomplikaatioiden ja synnytyksen biomarkkereina. Tässä tutkimuksessa löysimme proteomiikan ja genomin laajuisen assosiaatiotutkimuksen (GWAS) avulla entsyymin nimeltä Calcineurin-like phosphoesterase domain-containing protein 1 (CPPED1), joka mahdollisesti voi toimia spontaanin synnytyksen biomarkkerina. CPPED1-tasot laskivat spontaaneissa synnytyksissä, kun niistä saatuja istukoita verrattiin keisarinleikkauksen kautta saatuihin istukkoihin. Kun CPPED1-geenin ilmeneminen hiljennettiin istukan trofoblastisoluissa, tulehduksiin ja verisuonten uudismuodostukseen liittyvät signalointireitit muuttuivat eniten. Näillä muutoksilla saattaa olla merkitystä raskauden kestoon. Aikaisemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että virtsarakon syöpäsoluissa CPPED1 poistaa fosfaattiryhmän AKT1-entsyymin seriini-473 aminohapolta. Tämän fosfaatin poistaminen johti ohjelmoituun solukuolemaan AKT/PI3K-signalointireitin kautta. Meidän omissa tutkimuksissamme AKT1-entsyymin fosforylointi ei muuttunut istukan soluissa vaikkakin CPPED1:n määrä muuttui. Sen sijaan, CPPED1-määrän laskiessa PI3K-signalointireittiä negatiivisesti säätelevien proteiinien määrät lisääntyivät istukasta peräisin olevassa solulinjassa. Vertailevassa mikroRNAomiikassa, jossa vertailtiin alatiesynnytyksistä ja keisarinleikkauksista peräisin olevien istukoiden mikroRNA-molekyylejä, havaitsimme merkittäviä muutoksia 54 mikroRNA-molekyylien määrissä. Näistä 54 mikroRNA:stä 23 mikroRNA:n määrät nousivat ja 31 mikroRNA:n määrät laskivat spontaaneiden täysiaikaisten synnytysten istukoissa. Eräs mikroRNA, jonka määrä nousi spontaanin synnytyksen istukassa, oli miR-371a-5p. Osoitimme, että miR-371a-5p sitoutuu CPPED1:n lähetti-RNA:n 3’UTR-alueelle, minkä seurauksena lähetti-RNA:n määrä laski. CPPED1- ja miR-371a-5p-tasot siis korreloivat käänteisesti toisiinsa istukoissa, jotka ovat peräisin spontaaneista synnytyksistä. Näin ollen äitien verestä mitatut CPPED1 ja miR-371a-5p määrät voisivat olla potentiaalinen diagnostinen biomarkkeri spontaanin synnytyksen ennustamisessa. CPPED1:n toimintojen selvittämiseksi käytimme proteiinimikrosirutekniikkaa tunnistaaksemme proteiineja, jotka voisivat mahdollisesti olla vuorovaikutuksessa CPPED1:n kanssa. Kyseinen proteiinimikrosiru sisälsi noin 75% ihmisen solun kaikista proteiineista. Proteiinimikrosirumenetelmällä CPPED1:n osoitettiin sitoutuvan 36 erilaiseen proteiiniin. Näistä kahden proteiinin, PAK4:n ja PIK3R2:n, vuorovaikutukset CPPED1:n kanssa varmistettiin kahdella muulla menetelmällä. Immuunisaostuksen avulla osoitettiin, että CPPED1 muodosti tiiviin kompleksin sekä PAK4:n että PIK3R2:n kanssa. Kaksoisfluoresenssikomplementtimenetelmän avulla havaitsimme, että CPPED1 sijaitsi solun sisällä samoissa paikoissa kuin PAK4 ja PIK3R2. Lisäksi massaspektrometrianalyysillä osoitimme, että CPPED1 poisti fosfaattiryhmiä PAK4:n tietyistä seriiniaminohapoista; näiden fosforylointikohtien toiminnallinen merkitys PAK4:lle on vielä tuntematon. Siten CPPED1 merkitys PAK4:n ja PIK3R2:n toiminnoille vaatii vielä lisätutkimuksia.